磷酸钙纳米颗粒（CaP）蛋白负载与荧光探针修饰定制

Sur-Release公司，可根据需求设计蛋白负载方式、粒径尺寸、表面修饰及荧光标记方案。支持FITC、Cy5、Cy7等荧光染料引入，实现蛋白递送、细胞摄取追踪及成像分析一体化开发，满足不同科研应用需求。

图1｜磷酸钙纳米颗粒（CaP）蛋白负载与荧光探针修饰定制

◆ 一、纳米载体结构与参数定制

✦ 1.1核心结构设计

CaP纳米粒的核心结构可根据应用需求进行多层级定制：

纯CaP纳米粒：通过共沉淀法或微乳液法制备，粒径可控在30~150nm范围

脂质包被CaP（LCP） ：以CaP为内核，外覆不对称脂质双分子层，粒径25~150nm，具有更好的胶体稳定性和长循环能力

聚合物-CaP复合纳米粒：以PLGA等可降解聚合物为基质，内部原位生成CaP/蛋白复合物，提高蛋白包载稳定性

✦ 1.2关键参数定制范围

✦ 参数 ｜ 定制范围 ｜ 调控方法

✦ 粒径 ｜25~200nm｜ 水油比、反应时间、表面活性剂种类

✦ 表面电荷（Zeta电位） ｜ -30~+30 mV｜ 柠檬酸修饰、脂质涂层、靶向分子修饰

✦ 多分散系数（PDI） ｜ <0.20｜ 微乳液法、螯合控制沉淀法

✦ 载药量 ｜10~60 μg/mg｜CaP比例调控、蛋白/药物配比优化

✦ 1.3质量控制指标

粒径及PDI：动态光散射（DLS）检测，要求批间差异<15%

形貌：透射电镜（TEM）/扫描电镜（SEM）表征

晶相：X射线衍射（XRD）确认羟基磷灰石或无定形磷酸钙相

胶体稳定性：4℃及37℃下监测粒径变化，至少7天稳定

◆ 二、CaP纳米粒蛋白药物包载与荧光示踪体系介绍

磷酸钙（Calcium Phosphate, CaP）纳米粒因其良好的生物相容性、pH响应性降解特性以及良好的蛋白吸附能力，已成为蛋白药物递送领域备受关注的载体平台。CaP纳米粒能够在生理环境（pH 7.4）下保持稳定，而进入酸性内涵体/溶酶体（pH 4.5~5.0）后迅速降解，释放包载的蛋白药物，实现溶酶体逃逸和胞内递送。

在蛋白药物包载方面，CaP具有独特的优势：碱性蛋白可通过阳离子交换反应结合于CaP带负电荷的磷酸位点，而酸性蛋白（如牛血清白蛋白BSA）则通过金属配位作用与CaP的钙位点发生强相互作用。研究表明，引入CaP可将PLGA纳米粒中模型蛋白FITC-BSA的载药量从15 μg/mg提升至40 μg/mg，提升幅度达2.7倍。

荧光示踪体系的引入使得CaP纳米载体在体内的分布、细胞摄取及胞内转运过程可被实时监测。通过包载荧光标记蛋白（如FITC-BSA）或共递送pH敏感荧光蛋白探针（如Tandem蛋白：eGFP-mRFP1），可追踪纳米粒从内吞入胞到溶酶体酸化降解的全过程。这一体系为蛋白药物的胞内命运研究及药效评估提供了有力的可视化工具。

◆ 三、荧光示踪功能设计

✦ 3.1荧光标记蛋白直接包载

采用FITC、Cy5、Alexa Fluor系列等荧光染料标记目标蛋白，通过共沉淀法包载于CaP纳米粒中。适用于：

✦ 蛋白药物胞内分布追踪

✦ 体外细胞摄取定性/定量分析

✦ 组织切片荧光观察

✦ 3.2 pH响应型荧光探针共递送

包载Tandem蛋白（eGFP-mRFP1）可实现纳米粒进入内涵体/溶酶体过程的动态示踪：在生理pH下同时发出绿色和红色荧光，进入酸性环境后eGFP荧光淬灭，仅保留红色荧光，直观指示纳米粒的胞内转运阶段。

✦ 3.3近红外荧光示踪

包载DiR、Cy7等近红外荧光探针，用于活体小动物成像，追踪纳米粒的体内分布、肿瘤靶向及代谢清除。

◆ 四、蛋白药物负载策略

✦ 4.1原位共沉淀法（推荐）

将蛋白药物溶解于含Ca²⁺或PO₄³⁻的水相中，通过微乳液或双乳液体系混合，CaP与蛋白在油-水界面原位共沉淀，实现高效包载。该策略特别适用于：

酸性模型蛋白：FITC-BSA、卵清蛋白（OVA）

治疗性蛋白：抗体、细胞因子、酶制剂

pH敏感荧光蛋白探针：Tandem（eGFP-mRFP1）

✦ 4.2表面吸附法

预先制备CaP纳米粒，利用CaP表面的钙/磷酸位点吸附蛋白药物。适用于对包载过程敏感、不宜暴露于有机溶剂的蛋白。

✦ 4.3载药量优化

通过调节Ca/P比、蛋白初始投料量及反应体系pH，可优化载药效率。对于FITC-BSA模型蛋白，经超声辅助双乳液法结合CaP原位沉淀，可实现40 μg/mg的载药水平。

◆ 五、制备流程与质量控制

✦ 5.1推荐制备流程（以脂质包被CaP纳米粒LCP为例）

步骤1：反向微乳液法制备CaP核心

油相：环己烷 + IGEPAL-CO-520

水相1：CaCl₂溶液（pH 9.0）+ 蛋白药物

水相2：Na₂HPO₄溶液（pH 9.0）

混合搅拌 → CaP/蛋白共沉淀（~80nm）

步骤2：柠檬酸稳定化

加入柠檬酸钠 → 澄清化，表面带负电荷

步骤3：脂质包被

阳离子脂质（DOTAP）+ 胆固醇 + DSPE-PEG

自组装 → LCP纳米粒（~150nm）

步骤4：纯化

乙醇水洗脱 + 硅胶柱纯化

图5｜推荐制备流程（以脂质包被CaP纳米粒LCP为例）

✦ 5.2关键质控节点

✦ 质控节点 ｜ 检测方法 ｜ 接受标准

✦ 粒径与分散性 ｜DLS｜ 目标粒径±15%，PDI<0.20

✦ 载药量/包封率 ｜ 荧光定量/酶消化法 ｜ 载药量≥30 μg/mg

✦ 体外释放 ｜ 透析法+PBS（pH 7.4/5.0） ｜pH 5.0下24h释放≥80%

✦ 细胞摄取 ｜ 共聚焦/流式细胞术 ｜ 阳性率≥80%

✦ 无菌/内毒素 ｜ 凝胶法/鲎试剂 ｜ 内毒素<0.5 EU/mL

◆ 六、表面修饰与靶向功能拓展

✦ 6.1长循环修饰

PEG化：通过DSPE-PEG插入脂质涂层，延长体内循环时间，PEG比例可高达脂质总量的20%

透明质酸（HA）修饰：通过阿仑膦酸钠-HA接枝聚合物（AHA）锚定于CaP表面，提高胶体稳定性（>1个月），同时赋予CD44受体靶向能力

✦ 6.2主动靶向修饰

靶向肽：如肝癌靶向肽SP94，连接于纳米粒表面，增强肿瘤特异性摄取

叶酸：通过叶酸-配体修饰，靶向叶酸受体高表达肿瘤细胞

抗体/纳米抗体：针对特定肿瘤标志物的抗体偶联

✦ 6.3电荷反转设计

利用pH响应性电荷反转材料修饰CaP表面，在血液循环中保持负电荷减少非特异性摄取，到达肿瘤微环境（弱酸性）后转为正电荷促进细胞摄取。

◆ 七、性能表征与应用方向

✦ 7.1核心表征项目

✦ 表征类别 ｜ 具体项目 ｜ 目的

✦ 理化性质 ｜DLS粒径/电位、TEM形貌、XRD晶相 ｜ 确认纳米粒基本属性

✦ 载药性能 ｜ 载药量、包封率、体外释放曲线 ｜ 评估包载效率与释放行为

✦ 细胞水平 ｜ 细胞摄取（共聚焦/流式）、细胞毒性、胞内转运 ｜ 验证递送效率与安全性

✦ 动物水平 ｜ 活体成像、组织分布、药效学评价 ｜ 验证体内靶向与治疗效果

✦ 7.2主要应用方向

肿瘤靶向蛋白/多肽药物递送：抗体、细胞因子、肿瘤抑制蛋白

疫苗佐剂与抗原递送：促进抗原交叉呈递，增强免疫应答

基因/蛋白共递送：siRNA与蛋白药物协同治疗

胞内递送示踪研究：解析纳米药物的入胞机制与胞内命运

◆ 八、定制案例

案例一：CaP-rHDL脑胶质瘤靶向示踪体系

需求：构建可靶向脑胶质瘤的CaP纳米载体，包载DiR近红外探针用于活体成像。

方案：以CaP为核心，重组高密度脂蛋白（rHDL）包被，共包载DiR荧光探针。

图7｜案例一：CaP-rHDL脑胶质瘤靶向示踪体系

案例二：HA-CaP/siRNA靶向递送体系

需求：开发可全身给药、靶向肿瘤的siRNA递送系统，并追踪体内分布。

方案：CaP-siRNA共沉淀为核，阿仑膦酸钠-HA接枝聚合物（AHA）表面包被，粒径~170nm。

图8｜案例二：HA-CaP/siRNA靶向递送体系

◆ 九、定制产品推荐

基于上述技术体系，我们提供以下定制服务模块：

✦ 产品模块 ｜ 定制内容 ｜ 交付物

✦ CaP空白纳米粒 ｜ 粒径30~200nm定制，可选纯CaP/脂质包被/聚合物复合 ｜ 冻干粉/水悬液，COA报告

✦ 蛋白药物包载纳米粒 ｜ 目标蛋白（客户提供或我方表达）包载，载药量优化 ｜ 载药纳米粒，载药量/释放报告

✦ 荧光示踪纳米粒 ｜FITC/Cy5/DiR/近红外荧光标记，可选pH响应探针 ｜ 荧光标记纳米粒，活体成像可用

✦ 靶向功能化纳米粒 ｜PEG化、HA修饰、靶向肽/抗体偶联 ｜ 功能化纳米粒，靶向活性验证报告

✦ 定制制备服务 ｜ 按客户需求定制工艺，提供小试到中试规模 ｜ 工艺SOP，三批验证样品