《JCR》：复旦团队把羟氯喹装进可电离脂质——mRNA-LNP的炎症副作用，被一双手同时按了下去【图解】

◆ 图1 设计与初筛：HCQ既当"头"又当"药"，包封率一步封神

先补两句常识。脂质体/LNP是磷脂与胆固醇拼成的纳米油滴，可电离脂质在中性时不带电、酸性环境（如内体pH）里质子化带正电，靠静电力裹住带负电的mRNA，再帮它从内体脱身。HCQ这个分子有意思：抗疟出身的它侧链上自带一个可电离叔胺（计算pKa 9.219）和一个羟基，团队顺着羟基酯化上含羧基的疏水尾巴，一代代搭出HL-1至HL-6：一代用简单脂肪链尾（HCQ氮当可电离头），二代把HCQ接上TL-4或SM-102（HL-3、HL-5，分子里有俩可电离氮），三代换多分支无叔胺尾（HL-6）；另备不含HCQ的尾对照TL-4、SM-102、CL-17做归因。配方为HL:DSPC:胆固醇:DMG-PEG=50:10:38.5:1.5（摩尔比）、N:P=6:1、微流控混合：HL LNP粒径54–76 nm、PDI（越接近0粒径越均一）<0.2、包封率普遍>90%；HL-2因尾太短只有约60%，提示尾长重要。关键对照：TL-4包封率<5%（pKa 6.4太低、抓不住核酸），接上HCQ变HL-3后飙到95%以上——HCQ的碱性氮实打实参与包装。体内（BALB/c小鼠5 μg FLuc mRNA，静脉/肌肉，4/24/48 h生物发光）：HL-3两路均超MC3，HL-6静脉追平mRNA疫苗御用脂质SM-102，尾对照CL-17拉胯——氨基喹啉环对递送同样关键。最终锁定HL-3与HL-6（图1）。

图1 HCQ衍生可电离脂质设计合成、LNP制备与体内递送效率

◆ 图2 冻融挑战：SM-102"起泡"胀大，HL颗粒岿然不动

mRNA怕热怕折腾，LNP全程冷链要闯冻融关。团队把颗粒在−80 ℃或−20 ℃冻至少20 h、4 ℃解冻约2 h，连做五个循环：SM-102 LNP粒径逐步爬升，−20 ℃组尤甚；冷冻电镜（cryo-EM，把样品玻璃化后看颗粒真容）下其边缘长出bleb样"水泡"结构——粒径增大与团聚的元凶。而约60 nm起步的HL-3/HL-6 LNP两个温度段粒径、PDI、包封率都稳，形态无异常（图2A、B）。同图还藏着两个反常信号：TNS荧光法测表观pKa（探针只在颗粒带正电时发光，荧光骤降的pH即表观pKa，常规优等生约6.5），HL-3/HL-6在整个pH梯度上荧光贴底、压根算不出表观pKa；zeta电位-pH曲线（pH 5.2–8.3）里，常规LNP与荧光曲线亦步亦趋，HL-3/HL-6却在中性偏碱维持明显负电位。翻译成白话：同一张配方单做出来的两种颗粒，"长相"已经完全不同——HL LNP表面几乎不露正电脂质。为什么？留给图3。

图2 HL LNP冻融稳定性与反常的pKa/电位曲线

◆ 图3 结构揭秘：核磁+分子动力学，HCQ把脂质全拽进了内核

谁在表面、谁在芯里？团队把LNP透析进含5%重水（D2O）的缓冲液，用800 MHz高分辨核磁数表面氢原子：DMG-PEG主要铺在表面当"标尺"，据此量化三种脂质的表面占比。结果泾渭分明——载mRNA颗粒表面可电离脂质占全脂比例：SM-102为74.6%、HL-5（HCQ接SM-102）为71%，HL-3只有45.6%、HL-6仅29%；再折算可电离脂质"表面/内核"分布：SM-102约43.8%露在表面，HL-6只有5.3%，空颗粒也只是微升（8.1%）。分子动力学模拟给出画面感：HCQ的氨基喹啉环与RNA碱基堆叠成π-π相互作用、外加氢键，HL脂质之间也彼此纠缠，于是HL整体偏向内核、与mRNA强结合形成致密相分离结构（图3E–H）。图2的所有反常就此归位：表面没露多少可电离氮，TNS不亮、电位偏负；而"致炎触角"藏进内核，恰是低炎症的结构基础。稳定性更强、免疫"可见度"更低，一石二鸟。

图3 表面核磁定量与HL-mRNA的π-π堆积/氢键相互作用机制

◆ 图4 重复给药：四针连发，HL表达不降反超2–3倍

真实治疗哪有一针了事的？BALB/c小鼠尾静脉打FLuc mRNA-LNP，5 μg/只、间隔3天共4针，每针后4 h与72 h成像，首两针后4 h采血测六项细胞因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-1β、IL-2）：所有组表达随针次走低，SM-102跌得最狠；HL-3/HL-6从第二针起反超，表达是SM-102的2–3倍，13天总暴露量（AUC₀₋₁₃d）HL-6与SM-102持平。细胞因子侧SM-102与HL-5高高在上，HL-3/HL-6被死死按住。最妙的对照是HL-5：它是HCQ与SM-102的简单偶联物，炎症水平却跟SM-102难分伯仲——说明"往致炎脂质上缝一块HCQ"救不了它，决定炎症命运的是整体架构与表面暴露（呼应图3：HL-5表面可电离脂质仍占71%）。翻译成白话：抗炎不靠贴消炎药标签，靠把分子重新搭对。SM-102组的高细胞因子与表达衰减同步登场——炎症不仅难受，还在拆疗效的台（图4）。

图4 重复给药下HL LNP维持mRNA表达、压低促炎细胞因子

◆ 图5 机制与救命实验：混合颗粒梯度定责，致死毒性下100%存活

抑制炎症是脂质干的还是结构藏的？THP-1 Dual报告细胞（分泌型碱性磷酸酶SEAP读NF-κB通路、萤火虫荧光素酶Lucia读IRF通路）上场：强TLR3激动剂poly(I:C)（人工双链RNA）与FLuc mRNA按1:5共包LNP转染，SM-102两条通路全开，HL组双双压住，Lipo2000组细胞活力与表达齐崩。排掉"摄取不同"嫌疑靠混合颗粒：SM-102与HL-6按9:1、4:1、3:2配比，Cy5-EGFP阳性率各组持平（吃进去一样多），但HL-6占比越高、IRF与NF-κB活性越低——抑制量效关系干净利落。体内"极限施压"更硬核：poly(I:C)与mRNA改1:1共包，单次静脉注射5 μg或10 μg/只——SM-102组连5 μg都在48 h内全灭（IL-6约800倍、IFN-γ约100倍飙升，细胞因子风暴），HL-6组连10 μg都100%存活；5 μg档HL-6的IL-6、IFN-γ、IL-2显著低于SM-102（10 μg档优势缩小，超载了谁也扛不住）。一支抗炎脂质，真能在核酸毒性面前保命（图5）。

图5 HL阻断IRF/NF-κB通路的体外验证与poly(I:C)毒性保护实验

◆ 图6 疫苗验证：抗体照产、Th1照强，炎症归零

抗炎会不会把疫苗该练的免疫也"镇"没了？水痘-带状疱疹病毒（VZV）预防疫苗模型：选已上市重组疫苗Shingrix的御用抗原糖蛋白E（gE），HL-3/HL-6/SM-102包gE mRNA，C57BL/6小鼠肌肉免疫2 μg/针、三周后加强。体液：三组gE特异性IgG滴度相当，HL没有拖后腿；细胞：脾细胞经gE多肽池刺激做胞内因子染色（ICS）与ELISpot，HL-3/HL-6诱导出强Th1型CD4+ T细胞（IFN-γ、IL-2、TNF-α阳性），HL-3组gE特异性CD4+ T比例甚至显著高于SM-102组，Th2（IL-4/IL-5）几乎为零，CD8+应答弱（与前人VZV疫苗报道一致）。而接种后6 h的促炎因子：SM-102组2 μg低剂量也明显掀起IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1，HL组与辅料对照无异；加强后两周ALT/AST/肌酐等血生化及脏器病理无异常。一张图总结分工：LNPs进抗原呈递细胞表达gE，B细胞认蛋白、T细胞认肽段——适应性免疫照常轰鸣；HCQ在内体按住TLR——先天炎症静音（图6）。

图6 HL LNP带状疱疹mRNA疫苗的抗体、T细胞应答与炎症/安全性数据

◆ 图7 基因编辑：PCSK9敲掉约30%，血脂应声而落

最后一关离开疫苗，试需要"长效低炎"的基因编辑。PCSK9是调控低密度脂蛋白受体降解的蛋白，敲掉它→LDLR增多→血中"坏胆固醇"清得快，这是家族性高胆固醇血症的当红靶点。C57BL/6小鼠高脂饮食喂两个月建立高胆固醇模型，静脉注射Cas9 mRNA+sgPCSK9（3 mg/kg，包于HL-6或SM-102），第14天取肝做扩增子二代测序（NGS）：PCSK9靶位点插入/缺失（indel）编辑效率两组均约30%；血清PCSK9蛋白HL-6组降78%、SM-102组降83%（vs 阴性对照EGFP mRNA组），LDL-C与总胆固醇同步下降——编辑效力追平商用级脂质。附带一句sgRNA的化学修饰背景：2'-O-甲基加硫代磷酸末端的稳定化设计（S/mt），也是压先天免疫的常规手（图7）。

图7 HL-6递送CRISPR-Cas9编辑PCSK9：indel率、PCSK9蛋白与血脂变化

◆ 研究总结

本研究把羟氯喹的抗炎药理与可电离脂质的递送功能写进同一分子：HL-3/HL-6包封率>95%、静脉递送追平SM-102、五轮冻融不胀不漏；核磁与分子动力学证明氨基喹啉靠π-堆积和氢键把脂质锁进内核、表面几乎不露"炎性触角"；四针连发表达反超2–3倍，poly(I:C)致死攻击下100%存活，而VZV疫苗的抗体与Th1应答分毫不少，PCSK9编辑降蛋白78%。它给整个核酸递送领域立了新范式：载体不必只是载体——小分子药物也可以成为结构本身。换一种药理头、换一段尾部，同一设计语言就能重写下一批低炎症的LNP，尤其是saRNA、DNA这些"天生高炎"的载荷（图S1–S38提供合成路线、核磁归属与补充数据）。

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参考资料：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.114267
全文链接：https://doi.org/10.1101/2025.03.02.641033
声明：仅代表作者个人观点，用于研究用途，如有不科学之处，欢迎留言指正！

（配图说明：图片来自预印本bioRxiv服务器，发布前请核对正式版图；个别图若未抓到需手动截图。）

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