仿磷脂脂质 nanoparticle 装载环状RNA，CROSS系统让脊髓损伤小鼠六周恢复近正常步态（《Materials Today》）

◆ 一、（模式一：小节标题叙述式）

图1 设计示意、AP脂质合成路线与细胞筛库

◆ 二、仿生设计：给可电离脂质装上"磷脂头基"

细胞膜上的磷脂都是"一个亲水头+两条疏水尾"，负责膜的结构与内吞、胞吐等功能。受此启发，团队设计并合成了三系列可电离脂质：氨基磷酸酯（aminophosphate）、氨基膦酸酯（aminophosphonate）、氨基膦酰胺酸酯（aminophosphoramidate）衍生脂质（统称AP脂质）——把磷酰/膦酰基团嵌入头基，让合成载体更像"天然磷脂亲戚"，预期能强化与内体膜的相互作用。合成从醇与二苯基膦酸酯的酯交换反应起步：第一系列（如AP5）经Atherton-Todd反应引入膦酰胺酸酯/磷酸酯连接臂；第二系列（如AP52）由二烷基H-膦酸酯、醛、胺三组分一锅构建；第三系列（如AP60）走环氧化物开环路线。¹H NMR与质谱确证结构，共得67个成员组成脂质库。与DOPE、胆固醇、DMG-PEG按60:30:40:0.75摩尔比、脂质:mRNA质量比10:1经Nano L+系统乙醇-水相快速混合制粒，制备简单可放大（图1）。

◆ 三、67选1：AP60在神经元和星形胶质细胞中双优

用萤火虫荧光素酶（FLuc）mRNA封装67种LNP，在人神经母细胞瘤细胞系SY5Y与原代星形胶质细胞中过筛：7种LNP发光显著高于对照MC3（经典的肺靶向/肝靶向标杆脂质）；构效分析提示含T5、T8疏水域的脂质效率更高——推测与不饱和键和支链尾有关。MTT毒性测试综合排序，AP60当选：两种细胞系毒性低、体内生物相容性好。机制上，内吞通路抑制实验（用β-环糊精、dynasore、氯丙嗪、EIPA分别阻断小窝蛋白、动力蛋白、网格蛋白、巨胞饮通路）显示AP60主要经网格蛋白介导的内吞与巨胞饮入胞；钙黄绿素负载实验显示AP60比MC3把更多货物从内体"漏"进细胞质。体内验证更有说服力：SCI小鼠术中病灶局部滴注或尾静脉注射FLuc mRNA-LNP，AP60局部给药病灶信号为MC3的13.7倍、静脉给药4.6倍，而肝脏表达反而低约5倍——"多进脊髓、少进肝脏"，这正是中枢神经系统递送想要的分布画像（图2）。

◆ 四、一步法环状RNA：52°C下转录与环化同锅完成

环状RNA（circRNA）比线性mRNA更耐温度波动和核酸酶降解，配上IRES（内部核糖体进入位点，不依赖帽子结构的"另类翻译入口"）可以表达更高更久，但传统制备要五步：体外转录（IVT）→55°C环化→纯化……前后温度缓冲液不一致，耗时长、得率低。团队引入耐高温T7聚合酶（Hi-T7），让转录直接在52°C进行——环化温度就地达标，IVT与环化合并成一步。琼脂糖胶定量环状产物与前体比值：2500 bp产物Hi-T7为2.1±0.55、常规T7仅0.91±0.21；1500 bp为1.64±0.24对0.84±0.39——环化效率接近翻倍。流式细胞术还证实AP60对神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、OPCs多种细胞的递送效率全面优于MC3；HiBiT标签定量治疗蛋白：局注后Sox2达MC3的3.6倍、Ascl1达4.6倍，静脉给药Sox2提高约2.0倍（图3）。

◆ 五、表达持久性：circRNA第七天仍领先两个数量级

在T10段重度挫伤模型（显微下暴露脊髓、超细镊完全横向压榨30秒——最贴近人类机械性脊髓损伤的模型）局部给药后活体发光追踪：第1天线性与环状FLuc mRNA信号相当（1.5±0.3×10⁸ 对 1.2±0.08×10⁸）；但第3天线性RNA已跌至1.5±0.7×10⁷，第7天只剩1.6±0.1×10⁵；环状RNA高强度维持近5天，第7天仍有2.2±1.2×10⁷——信号差出三个数量级。而且circRNA组IL-6低于线性mRNA组，炎症反应更温和。翻译成白话：想在一周内持续供给重编程与营养因子，circRNA+AP60是比mRNA更合适的选择。

◆ 六、体外重编程：OPC变神经元，AP60组多3倍

OPCs以NG2标记鉴定培养，转入环状Sox2+Ascl1（gpt1介质含神经营养因子，故体外不加GDNF），以神经元标志Map2与星形胶质标志GFAP计数分化结局：AP60组新生神经元88.0±34.2个，显著高于MC3组53.7±11.0与未处理对照22.0±4.0；三组星形胶质分化无差异——递送效率红利精准落在"变神经元"这一支，没有旁逸到胶质方向。

◆ 七、体内疗效：两周膀胱近乎复原，六周步态接近正常

治疗方案分两段：术中把装载环状Sox2+Ascl1（摩尔比1:1、每只1 mg/kg mRNA）的CROSS直接滴在T10病灶（50 μL分次滴加、停留15分钟吸渗），术后每周静脉注射装载环状GDNF的CROSS维持营养。膀胱功能用超声测残余尿：伤后第1天PBS与CROSS组无差（249.4±32.7 对 265.8±25.7 mm³）；一周后CROSS组降到138.2±36.0，PBS组仍225.7±38.5；两周时CROSS组残余尿仅61.7±27.6 mm³，与健康小鼠43.28±20.5 mm³已无统计学差异（PBS组193.9±28.2）——两周内膀胱功能基本满血复活。BBB运动评分（0分完全瘫痪、21分与正常鼠无异）：伤后两组同起点1.8分；四周CROSS组14.3±1.8、PBS组11.3±2.1，CROSS组已出现持续性负重踏步；六周CROSS组17.0±3.0接近正常，PBS组原地踏步11.2±2.9。组织学：CROSS组Map2⁺神经元更贴近胶质瘢痕（GFAP）边界，髓鞘碱性蛋白MBP与神经丝NF200信号更强——轴突长出来了、也髓鞘化了；BrdU（胸苷类似物，标记增殖中新生的细胞）与Map2双阳的"新生神经元"在病灶边界成倍出现：PBS组8.9±4.7 对 CROSS组27.7±11个（p<0.01）（图4、5）。

本研究构建了仿生AP脂质LNP与一步法circRNA制备的交叉创新体系CROSS，把"手术时原位重编程+康复期静脉营养"两段式方案做进了同一载体：局部递送效率为MC3的13.7倍、肝脏蓄积低近5倍、第七天表达高两个数量级，两周恢复排尿、六周恢复步态，且避开病毒载体长期表达的致癌隐忧（CROSS表达窗口7–10天、可反复给药）。其可迁移性同样清晰：AP脂质库可换、环状RNA编码因子可换——把Sox2/Ascl1/GDNF换成其他重编程组合或营养因子，把脊髓换成脑卒中、视网膜等CNS损伤灶，同一"仿生脂质+环状RNA+两段给药"框架有望讲出新的神经修复故事。

图5 病灶Map2+BrdU双标免疫荧光，新生神经元计数

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参考资料：https://doi.org/10.1016/j.mattod.2025.10.005
全文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12571231/pdf/nihms-2118428.pdf
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