《Cell Rep Med》：一剂环状RNA疫苗针，IL-15+抗PD-L1纳米抗体双管齐下，把4种冷肿瘤烧热【详读】

来源于：纳米医学网 | 作者：小 N | 发布时间：2026-10-28 | 浏览：3

《Cell Rep Med》：一剂环状RNA"疫苗针"，IL-15+抗PD-L1纳米抗体双管齐下，把4种冷肿瘤烧热

《Cell Rep Med》：一剂环状RNA

PD-1/PD-L1 checkpoint抑制剂（免疫检查点抑制剂，通俗说就是"松开免疫刹车"的抗体药）不断获得FDA批准，单药与联合方案此起彼伏，可晚期肿瘤的临床试验获益依旧有限。症结在于"冷肿瘤"：体细胞突变率低、淋巴细胞浸润稀少、PD-L1表达低迷——免疫系统根本没把它当敌人。免疫细胞因子（IL-2、IL-7、IL-12、IL-15等T细胞扩增殖与功能调控因子）理论上能把冷肿瘤"加热"，与检查点抑制剂联手可放大抗肿瘤应答，但重组蛋白药的临床转化被三座大山压住：全身毒性、多效性副作用、以及合成与质控的昂贵成本。环状RNA（circRNA，共价闭合的单链RNA，因无游离末端而免于外切酶降解，比线性mRNA更稳定）被视作下一代RNA治疗平台，可其制备技术同样不成熟：广泛使用的PIE（排列内含子-外显子）自剪接法会把外源辅助序列作为"疤痕"缝进环内，可能改变折叠、形成类双链RNA结构而诱发不受控的免疫原性；纯化端，RNase R无法彻底消化线性杂质（带7 nt以上3'单链突出头的都消化不动），HPLC又分不开分子量相近的线性RNA。为此，陆军军医大学Dun Niu（牛敦）等（通讯作者Jiqin Lian等）构建了无缝环化载体circCV-B3与亲和纯化体系BAPS，设计共编码IL-15与抗PD-L1纳米抗体的circILNb，包入LNP瘤内注射，在四种晚期冷肿瘤模型中激发强效系统免疫。成果发表于Cell Reports Medicine（2025，DOI: 10.1016/j.xcrm.2025.102413）。

◆ 一、无缝环化：把"剪刀口"藏进IRES肚子里

circCV-B3的巧思在于"消灭疤痕"。PIE法靠T4td组I催化内含子自剪接环化，连接位点须保留E1（TTGGGT）与E2（CT）两个短模体；团队的做法是扫描候选IRES序列，发现CVB3 IRES内部恰有两段可与E1E2匹配的序列——把IRES第555位的G突变为C，拼出完整的TTGGGTCT，环化时剪掉内含子、E1与E2重新相连，最终产物里"缝合口"完全由天然序列构成，外源疤痕清零。二级结构预测确认突变1对IRES折叠影响可忽略（图1A）。把环化元件、IRES片段与下游限制性酶切位点（用于插入任意编码序列CDS）组装进带T7启动子的质粒，即得通用载体。毛细管电泳测得环化效率达90%，Sanger测序确认环连接点正确，RNase R富集实验证实环状分子存在。更关键的是模块化：换靶标只需更换插入的CDS，不必为每段序列重调内含子，也不需加长间隔序列——这正是它优于II型内含子策略之处。

◆ 二、BAPS纯化：专挑"接缝"下手，磁力珠一步拉纯

纯度是环状RNA安全性的命门，残留线性RNA与合成效应物高度免疫原。团队的思路极直接：连接点序列是circRNA独一无二的"身份证"，那就针对它做亲和捕获。设计末端带生物素的DNA探针，与变性后的RNA产物在65°C结合缓冲液（20 mM Tris-HCl、1.0 M LiCl、2 mM EDTA，pH 7.5）中退火，链霉亲和素磁珠拉下"探针-circRNA"复合物，55°C预热的洗涤缓冲液洗5遍去杂，最后65°水洗洗脱，即得高纯环状RNA——全称为biotin-avidin purification system，简称BAPS。相比琼脂糖胶回收、polyA引入或HPLC，BAPS避开分子量重叠难题，工艺也便宜得多，难点被诚实地列了出来：变性要充分（否则接缝露不出来）、探针GC含量与长度要精调、退火条件既要抓住环又不能抓得死到洗不下来。

◆ 三、双 cargo设计：IL-15加热+纳米抗体松刹车

circILNb一只环同时编码两个药：IL-15（驱动CD8+ T与NK细胞扩增殖、存活与杀伤功能的免疫细胞因子）与抗PD-L1纳米抗体。解释一句：纳米抗体（Nb）取自骆驼科重链抗体的可变域（VHH），是已知最小的抗原结合抗体片段，仅约15 kDa、长约2.5 nm，亲和力高、溶解性好、组织穿透强、免疫原性低——但半衰期短、缺乏多价性，所以既往研究借细菌、慢病毒载体让它原位表达。西方印迹证实：HEK293T转染circILNb后，培养上清同时检出IL-15与HA标签Nb，且共表达优于“circIL+circNb两环混注”的共转染（图1C）。动物层面，B16F10荷瘤小鼠瘤内注射0.5 mg/kg circILNb，免疫荧光显示肿瘤实体内PD-L1（红）与Nb（绿）大量共定位（黄）——纳米抗体在原位把PD-L1“占领”了（图1D）；流式进一步显示Nb表达同时覆盖CD45+浸润白细胞与CD45−肿瘤细胞（图1E、F）。

◆ 四、瘤内"药库"：血里24 h清零，瘤里驻留6天

安全性是细胞因子疗法的生死题。药代数据显示：IL-15入血后瞬时冲高，24 h内被外周血清除干净——外周暴露窗口极短；相反，circIL与circILNb在瘤内持续编码，IL-15瘤内驻留至少6天，形成"局部药房"。脾脏重量对IL-15类药的全身免疫激活高度敏感，circILNb组较PBS与对照环circScram（circLuc）无显著增加；肝毒指标ALT/AST、循环IFN-γ与IL-6、外周NK细胞水平均未见显著抬升——瘤内给药把IL-15"锁"在瘤里。剂量爬坡实验给出依赖关系：各环呈剂量依赖抑瘤，0.5 mg/kg中等剂量的circILNb已能最显著抑制肿瘤并延长生存；据此定下后续统一剂量。

◆ 五、四模型普适：黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌全线起效

疗效验证选了四个典型冷肿瘤：B16F10黑色素瘤、RM-1前列腺癌、4T1乳腺癌（原位脂肪垫接种）、CT26结肠癌，肿瘤长至约150 mm³才起治——刻意模拟"晚期"。结果所有模型中单用circNb抑瘤最弱，circILNb的肿瘤抑制与生存延长全面最优，B16F10模型尤为突出，且各组体重无显著变化（图2B–I）。机制解剖显示，二次给药后的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）图谱被重写：CD45+总白细胞占比上升，CD4+总量不变但免疫抑制性的CD4+Foxp3+ Treg显著减少，细胞毒性CD8+ T与NK、NKT细胞显著扩增至CD8/Treg比值大幅抬升；CD8+ T的Ki67（增殖标志）、IFN-γ与颗粒酶B（杀伤分子）全面上调（图3B–I）；RNA-seq热点图与qPCR（Tbx21、Tnf、Xcl1升高）佐证活化表型（图3J、K）。细胞清除实验锁死主效应细胞：敲除CD8+或NK均显著削弱疗效，两者同时敲除则疗效完全归零；用FTY720把外周淋巴细胞"关"在淋巴结里，局部疗效不受影响——起效主力是瘤内预存TIL的再激活。

◆ 六、淋巴结再编+远端效应：局部一针，全身应答

树突状细胞（DC）是连接局部与系统的信使：tdLN（肿瘤引流淋巴结）中检出表达Nb的DC，DC成熟被促进；体外BMDC呈递OVA肽（SIINFEKL）与CD8+ T共培养实验显示，circILNb-loaded DC显著增强CD8+ T扩增殖。给瘤内剂量后24 h，tdLN的CD8+ T出现强STAT5磷酸化——持续STAT5信号可把耗竭T"改写"回效应表型。四聚体追踪（H-2Kb-OVA tetramer，识别抗原特异性T细胞的分子条形码）显示：tdLN中tetramer+ CD8+ T扩增殖、数量上升，并上调肿瘤特异性记忆细胞Ttsm（CD44+TCF1+TOX−）分化；瘤内则富集干细胞样耗竭表型Tsle（PD1+TCF1+TIM3−）——这支"预备役"正是检查点阻断响应与长期免疫的地基。效应最终兑现于远端：双侧种瘤仅右侧给药，未治侧肿瘤被清除、小鼠长期存活；静脉注射B16F10模拟肺转移，circILNb显著削减肺转移结节数（图5B–F）。机制上，远端效应可被CD8+ T清除（而非NK清除）或FTY720完全废除，且未治瘤内未检出IL-15或Nb——不是药跑过去了，而是被"教育"过的CD8+ T跑过去了。外周血tetramer+ CD8+ T占比上升，短寿效应细胞Tse与双阳效应Tdpe增多，完成效应向记忆的分化重排。

◆ 七、对垒蛋白药：比N-803+αPD-L1更强还更稳

头对头实验直接叫板临床药物：N-803（Inbakicept，IL-15超激动剂融合蛋白，200 μg/kg）联合抗PD-L1抗体（10 mg/kg），无论皮下+腹腔还是瘤内给药，在B16F10、4T1、CT26模型仅轻度抑瘤且全部模型出现显著体重下降；circILNb单针瘤内即实现更强抑瘤、更长生存与更小的全身折腾，仅RM-1模型两者相当（图6B–M）。与临床前新型偶联药N-809（N-803与PD-L1结合域融合，2 mg/kg）的对比中，circILNb在B16F10显著占优、4T1与CT26全面占优，仅RM-1瘤内给药相当。

本研究建立了"无缝环化载体circCV-B3+BAPS接头纯化+LNP包封"的环状RNA工程化全链条，把IL-15与抗PD-L1纳米抗体编进同一只环，以瘤内一针实现"局部药房+淋巴结教学+全身效应"的免疫三级火箭，在四种晚期冷肿瘤中超越细胞因子+抗体联用的蛋白药组合。其可迁移性同样清晰：换一段CDS，就是另一种细胞因子或抗体片段；换成肿瘤特异抗原编码序列，这套平台几乎可以原地平移成一类"自装配mRNA疫苗"。RNA在体内"当厂造药"，或许比注射药本身更便宜、更持久、更安全。

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参考资料：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2025.102413
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2025.102413
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（本文配图缺失，发布时需从原文 DOI 手动截图）

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