《Cell Rep Med》：一剂环状RNA「疫苗针「，IL-15+抗PD-L1纳米抗体双管齐下，把4种冷肿瘤烧热

图1 载体设计：把"缝合口"藏进IRES，无缝环化一步到位
circRNA药物第一问：怎么环得干净？研究者的答案是"藏"。PIE法依赖T4td组I催化内含子自剪接，连接需要保留E1（TTGGGT）与E2（CT）两段短模体——传统做法它们会作为疤痕留在环上。团队扫描发现CVB3 IRES内部恰有匹配E1E2的序列，将IRES第555位G点突为C，拼出完整TTGGGTCT：剪接时内含子在E1/E2之间被切下并自我连接，环化完成后E1与E2严丝合缝恢复成天然IRES序列——成品环上外源疤痕长度为零，连接点完全是"原装"序列（图1A）。二级结构预测确认这处突变对IRES折叠几乎无影响，毛细管电泳给出90%环化效率，Sanger测序与RNase R富集实验交叉确认环状结构与连接点正确。载体上预留限制性酶切位点簇（RES），任何目的CDS插进去就能出环，无需按序列定制内含子——白话讲，这是一台"通用装订机"，装订口还看不见订书钉。同一载体随后出货三款产品：单编IL-15的circIL、单编抗PD-L1纳米抗体的circNb、双cargo的circILNb（图1B）。功能验证干净利落：HEK293T转染后上清Western blot同时检出IL-15与HA标签Nb，且双链共编circILNb的表达优于两环混转（图1C）；B16F10荷瘤鼠瘤内注射0.5 mg/kg后，免疫荧光图像里PD-L1（红）与Nb（绿）在肿瘤实体大片重叠成黄——抗体在原位"占领"了PD-L1（图1D）；流式再显示Nb表达覆盖CD45+浸润白细胞与CD45−肿瘤细胞两个群体（图1E、F）。

图2 剂量与四模型：0.5 mg/kg单药横扫四种"晚期冷肿瘤"
疗效要先过剂量关。梯度给药显示各circRNA均剂量依赖抑瘤，0.5 mg/kg中剂量circILNb已显著抑制肿瘤并延长生存，据此定为统一工作剂量。治疗窗口刻意压晚：肿瘤长到约150 mm³才起治，模拟临床晚期。四个模型依次登场——B16F10黑色素瘤、RM-1前列腺癌、4T1乳腺癌（乳腺脂肪垫原位接种）、CT26结肠癌，每模型n=5只、q5d瘤内给药。结果排座次清晰：单用circNb几乎垫底，circILNb在四模型中抑瘤与生存全面最优，黑色素瘤最惊艳，且体重曲线平稳（图2B–I）。翻译成白话：纳米抗体单打独斗（只松刹车）不够看，把IL-15（踩油门）编进同一只环，一剂就拉开了差距——这正是"协同"二字的动物学注脚。

图3 TIL重排：CD8+与NK扩增殖，Treg缩位，杀伤分子拉满
药进了瘤，谁被唤醒了？二次给药后取肿瘤做流式套餐：CD45+总白细胞占比上升，CD4+总量不动但免疫抑制性的CD4+Foxp3+ Treg显著下降，毒性主力CD8+ T显著扩张，NK与NKT同步上调，CD8/Treg比值大幅抬升（图3B、C）。活化读数同样亮眼：CD8+ T的Ki67（增殖标志物）平均荧光强度升高，IFN-γ+占比与颗粒酶B（GrzmB，穿孔素依赖的杀伤弹头）MFI显著上升，NK细胞的Ki67、IFN-γ、GrzmB同步走强（图3D–I）。TIL转录组热图上活化/毒性标志物集体上调，qPCR确认Tbx21（T-bet，效应程序主转录因子）、Tnf、Xcl1升高（图3J、K）。因果链靠三组"拆除实验"钉死：抗CD8或抗NK1.1抗体清除相应细胞，疗效显著缩水；两者同清，疗效归零；用FTY720（1 mg/kg起、隔日0.5 mg/kg）把外周淋巴细胞锁进淋巴结，局部疗效却不受影响——主力是瘤内"原住民"TIL的就地再激活，而非外围援军（补充实验）。

图4 淋巴结教学：p-STAT5点亮，四聚体追踪到"预备役"扩增
局部一针如何变成系统免疫？信使是树突状细胞（DC，专职把抗原"上课"给T细胞的抗原呈递细胞）。tdLN（肿瘤引流淋巴结）中检出表达Nb的DC，DC成熟度上调；体外骨髓源DC负载OVA肽SIINFEKL后与CFSE标记的CD8+ T共培养，circILNb处理组的DC显著增强T细胞扩增殖（补充实验）。机制信号同样直接：瘤内给药24 h后tdLN的CD8+ T出现强STAT5磷酸化——IL-15经由p-STAT5通路把耗竭T改写回效应表型（图4A、B）。用H-2Kb-OVA四聚体（给抗原特异性T细胞刷"分子条形码"）追踪：tdLN里tetramer+ CD8+ T增殖标志Ki67 MFI升高、总数扩增（图4D、E），肿瘤特异性记忆细胞Ttsm（CD44+TCF1+TOX−）分化上调（图4F）；瘤内则富集干细胞样耗竭表型Tsle（PD1+TCF1+TIM3−）——自我更新、随时可被检查点阻断"激活出库"的那支预备役（图4G）。终末读数是肿瘤内tetramer+ CD8+ T数量增加，IFN-γ+与GrzmB+亚群显著扩增（图4H–J）。

图5 远端效应：只打一侧瘤，另一侧被"清空"；肺转移灶同步削减
局部治疗能否管到全身？双侧种瘤、仅右侧给药的abscopal实验给出肯定答案：circILNb组未治侧肿瘤被排斥清除、小鼠长期存活（图5B、C）；静脉回输B16F10细胞模拟血行转移，14天后取肺数结节，circILNb显著压低肺转移灶数量（图5D–F）。归因实验漂亮：清除CD8+ T（而非NK）即废除远端效应，FTY720锁定淋巴细胞同样废除；而未治瘤内检不出IL-15或Nb——疗效不是药物"漏"过去的，是被淋巴结"教育毕业"的CD8+ T巡游过去的。外周血证据与之闭环：tetramer+ CD8+ T占比可观上升（图5G），短寿效应细胞Tse（KLRG1+CD127−）显著增多、双阳效应Tdpe增加，记忆前体Tmpe占比下降——效应分化时钟被拨快，援军正在路上（图5H、I）。

图6 头对头蛋白药：更强抑瘤、更长生存、更少折腾
临床转化的必答题：比在售药好在哪？对照选择N-803（Inbakicept，IL-15超激动剂-IL-15Rα/Fc融合蛋白，200 μg/kg）联合抗PD-L1克隆10F.9G2（10 mg/kg），皮下+腹腔或瘤内两种给法都试：B16F10、4T1、CT26模型中该组合仅轻度抑瘤，且四模型全线出现显著体重下跌；circILNb单剂瘤内更强抑瘤、更长生存、体重平稳，仅前列腺癌RM-1与联用相当（图6B–M）。再对垒临床前ADC样融合蛋白N-809（N-803与PD-L1结合域偶联，2 mg/kg）：B16F10模型circILNb显著占优，4T1与CT26全面占优，RM-1模型两者相当（补充实验）。一剂环状RNA压过"蛋白药组合拳"，逻辑就藏在药代里：IL-15入血24 h内清零、瘤内驻留≥6天——疗效窗口留在肿瘤，毒性窗口避开全身。

研究总结
本研究用无缝环化载体circCV-B3（环化效率90%）与共编码设计造出circILNb，以BAPS接头亲和纯化与SM-102基LNP（摩尔比50:10:38.5:1.5，微流控1:3混合）完成"制药-纯化-封装"工程化闭环；瘤内注射在B16F10/RM-1/4T1/CT26四种晚期冷肿瘤中显著抑瘤延寿，机制上就地扩增CD8+/NK、经tdLN完成抗原特异性T细胞再编（p-STAT5、Ttsm、Tsle），并驱动远端瘤与肺转移的CD8+ T依赖性清除，安全性优于N-803+αPD-L1与N-809蛋白药。它证明了"RNA原位编码双功能免疫药"的可行性——换一段CDS，就是另一个细胞因子或抗体片段；把cargo换成肿瘤抗原，同一平台即刻变身自装配环形mRNA疫苗。

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参考资料：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2025.102413
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